LABORATORIO DE URGENCIAS

Gran Desregulación Transcriptómica en la Corteza Cerebral en TEA

                                                                                        Michael Gandal; Jillian Haney; Brie Wamsley; Chloe Yap; 
                                                                                        Sepideh Parhami; Nathan Chang; Christopher Harti;
                                                                                        Mark Gerstein; Daniel H. Geschwind et al   

                                                                                                                   Nature (2022); vol 611, pages: 532–539 

Al igual que otros trastornos neuropsiquiátricos, los factores de riesgo del TEA implican un componente genético sustancial, profundamente complejo y multifactorial, que involucra a cientos de genes de riesgo. Sin embargo, a pesar de la heterogeneidad etiológica, los estudios de perfil molecular en el TEA han encontrado patrones consistentes de desregulación transcriptómica y epigenética que afectan a la corteza frontal y temporal en la mayoría de los casos. Se desconoce si esto representa una patología molecular focal, regional o más generalizada. Comprender la naturaleza y la distribución de estos cambios moleculares es esencial para descifrar las bases neurobiológicas del TEA.

Cambios transcriptómicos a nivel de la corteza cerebral en el TEA
En este estudio, realizamos un análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) para identificar cambios en genes y transcripciones (isoformas génicas con empalme alternativo) en 725 muestras que abarcan 11 regiones cerebrales distintas y los cuatro lóbulos corticales (frontal, parietal, temporal y occipital), incluyendo áreas de asociación múltiple y sensoriales primarias, de 49 individuos con TEA idiopático y 54 controles neurotípicos emparejados. En comparación con trabajos previos, esto representa un aumento de más del triple en el número de muestras y regiones analizadas. En consonancia con el aumento de la potencia estadística, encontramos 4223 genes y 9474 transcripciones (tasa de falsos descubrimientos [FDR] < 0,05) que se expresaron de forma diferencial a nivel de la corteza cerebral, un aumento notable en comparación con análisis previos. Identificamos señales de expresión diferencial distintivas en las transcripciones que a nivel genético. Los cambios en las transcripciones mostraron una mayor magnitud de efecto en el TEA que en sus genes correspondientes, lo que respalda un papel sustancial del empalme alternativo y la expresión de isoformas en el TEA, en consonancia con la partición de la heredabilidad de variantes comunes y análisis transcriptómicos previos. A continuación, buscamos determinar la consistencia regional de estos patrones calculando la expresión diferencial por separado dentro de cada región cortical y comparando los cambios regionales en el tamaño del efecto (log² fold change [FC]) con la firma correspondiente de toda la corteza. Si bien el número de genes con expresión diferencial varía considerablemente, lo que podría reflejar diferencias en el tamaño de la muestra, observamos firmas transcriptómicas consistentes del TEA en todas las regiones corticales analizadas, con cambios en el tamaño del efecto altamente concordantes en cada región en comparación con la firma de toda la corteza. Observamos la mayor señal en la corteza visual primaria (BA17), con 3264 genes con expresión diferencial, de los cuales el 59 % se superponía con los observados globalmente. Además, los cambios en la magnitud del efecto fueron significativamente mayores en BA17 en comparación con la señal de toda la corteza, lo cual no se observó en ninguna de las otras regiones evaluadas. En conjunto, estos resultados demuestran una firma transcriptómica consistente del TEA en toda la corteza, que es más pronunciada posteriormente en BA17.
A continuación, evaluamos la expresión diferencial de genes y transcritos en 83 muestras pancorticales adicionales de 9 sujetos con síndrome dup15q materno, un trastorno genético poco común caracterizado por duplicaciones en la región cromosómica 15q11-q13. El síndrome dup15q es una de las formas más comunes de TEA sindrómico, y se ha demostrado previamente que los cambios en la expresión génica en estos sujetos presentan un fuerte paralelismo con los cambios genéticos del TEA idiopático en la corteza frontal y temporal, pero con una mayor magnitud del efecto5. Replicamos estos resultados previos ampliamente en las regiones corticales examinadas, encontrando una superposición sustancial en los cambios transcriptómicos entre dup15q y el TEA idiopático. Además, dup15q exhibe una mayor magnitud de desregulación de la expresión génica. En general, BA17 también mostró el mayor número de genes expresados ​​diferencialmente en dup15q.
Estos resultados demuestran que la patología molecular compartida por esta rara forma genética de TEA y el TEA idiopático está extendida en distintas regiones de la corteza, y que existen algunos puntos en común en la varianza regional del efecto, ya que ambas afecciones afectan tanto a áreas sensoriales como a áreas de asociación de orden superior.

Atenuación de la identidad regional
En el cerebro neurotípico, las regiones corticales pueden distinguirse mediante diferencias en la expresión génica, que reflejan principalmente la variabilidad en la citoarquitectura, la conectividad y la función de cada región, siendo V1 la más distintiva. Previamente, observamos una marcada atenuación de estas diferencias típicas de expresión génica entre dos regiones (lóbulo frontal y temporal) en el TEA4,5, lo que denominamos aquí atenuación de la identidad regional transcriptómica (IRA).
Esta reducción significativa en la magnitud de las diferencias de expresión génica entre estas dos regiones de asociación corticales sugirió una alteración en sus patrones de desarrollo, conectividad y/o funcionamiento continuo en el TEA. En este estudio, buscamos comprender el alcance de estas alteraciones moleculares para determinar si eran focales o más generalizadas, involucrando regiones de asociación o sensoriales adicionales.
Primero, contrastamos sistemáticamente todos los pares únicos de 11 regiones corticales (55 comparaciones en total) utilizando un enfoque estadístico conservador basado en permutaciones para explicar las diferencias en el tamaño de la muestra entre las regiones. Validamos la robustez de los patrones de identidad regional transcriptómica observados en los controles al compararlos con los del Atlas Cerebral Allen13. Diez pares de regiones mostraron un ARI significativamente mayor en TEA en comparación con los controles, basándose en la permutación, y 41 de los 55 pares de regiones adicionales mostraron una atenuación significativa en TEA utilizando otro enfoque complementario basado en bootstrap.Estos resultados demuestran que las diferencias en la expresión génica que diferencian las regiones corticales se reducen significativamente en TEA, lo que produce regiones corticales más homogéneas molecularmente.

Variación Regional
Encontramos 13 módulos que mostraron patrones de desregulación regionalmente variables en TEA, todos los cuales también mostraron gradientes de expresión anteroposteriores en muestras neurotípicas. Sin embargo, ninguno de estos módulos se enriqueció significativamente con variantes de riesgo genético conocidas para TEA. Las alteraciones más pronunciadas se observaron en BA17, con cuatro módulos que mostraron asociaciones significativas con TEA que solo fueron detectables en esta región. Estos incluyen GeneM30, un módulo OPC con genes centrales como SOX4 y SOX11. Otro, GeneM4, es un módulo neuronal inhibidor que contiene numerosos genes importantes para diversos procesos de señalización intracelular y maduración, como SCN9A. GeneM4 está significativamente enriquecido con ARN no codificantes intergénicos largos (lincRNA) y con módulos génicos previamente descritos asociados con vías de expresión positiva relacionadas con el desarrollo5 y la señalización1,6 en TEA, aunque observamos este efecto en BA17 por primera vez.
Doce módulos regionalmente variables mostraron un enriquecimiento significativo en genes que comprenden la señal ARI, lo que indica que estos módulos contribuyen a las identidades regionales transcriptómicas observadas en controles neurotípicos, pero que están atenuadas en TEA. Seis de estos módulos se expresaron con mayor intensidad en las regiones posteriores que en las anteriores en sujetos neurotípicos y se observó una expresión negativa en TEA a lo largo de la corteza. Estos incluyeron GeneM3, un módulo neuronal enriquecido para la generación de energía y procesos neuronales altamente dependientes de la energía, como el transporte y la liberación de vesículas. Cuatro módulos se expresaron con mayor intensidad en las regiones anteriores que en las posteriores en sujetos neurotípicos y mostraron una regulación positiva a nivel de la corteza cerebral en TEA, lo que atenuó este patrón. Estos incluyen GeneM8, un módulo microglial que contiene genes involucrados en la señalización inmunitaria y la fagocitosis; y GeneM7, un módulo de respuesta inmunitaria que contiene genes como las vías de respuesta a NF-κB e interferón. Si bien se ha descrito previamente una regulación negativa neuronal y de oligodendrocitos, junto con una regulación positiva inmunitaria y de la microglía en TEA, estos hallazgos indican que esta desregulación está generalizada en toda la corteza cerebral, con una mayor magnitud en las regiones posteriores, un patrón que es más pronunciado en BA17.
A continuación, buscamos determinar el factor desencadenante de los cambios observados en la magnitud del efecto del TEA en las distintas regiones. Está bien establecido que BA17 es la región con mayor densidad neuronal del cerebro humano, con una notable expansión del grosor de la capa 3/4 (L3/4), en comparación con otras regiones corticales
De forma similar, se observa un gradiente anteroposterior de aumento de la densidad neuronal en ratones y primates. Postulamos que la variación regional en la densidad neuronal o el grosor laminar podría contribuir a las diferencias regionales en la magnitud del efecto del TEA. La densidad neuronal regional en múltiples regiones cerebrales no se ha caracterizado cuantitativamente en el cerebro humano, pero se han establecido tales gradientes en algunas regiones de primates no humanos.
Por lo tanto, comparamos los cambios en el tamaño del efecto del TEA específicos de cada región en nuestros módulos genéticos con la densidad regional de núcleos neuronales medida en primates25 para seis regiones coincidentes de distintas especies. Observamos una correlación significativa entre el grosor de L3/4, la densidad neuronal y los tamaños del efecto para varios módulos desregulados en el TEA.

Discusión
Los hallazgos presentados aquí refinan sustancialmente nuestra comprensión de la patología molecular del TEA más allá de las categorías funcionales previamente establecidas de «neurona regulada a la baja» y «glía/inmunidad regulada al alza» observadas en los lóbulos frontal y temporal. Identificamos cambios en la expresión génica y transcripcional en el TEA que ocurren en la corteza cerebral y que afectan a numerosos tipos de células neuronales y procesos biológicos específicos, extendiéndose más allá de las áreas de asociación de orden superior para incluir áreas sensoriales primarias, especialmente en BA17.

Observamos que las características de expresión génica observadas recientemente, como la sobreexpresión de astrocitos reactivos y la disminución del transporte de la membrana de la barrera hematoencefálica1, están presentes en toda la corteza cerebral en el TEA.
Sorprendentemente, los cambios más profundos en la expresión génica en el TEA se observaron en la corteza visual primaria (BA17).
Es interesante especular que los cambios sustanciales observados en las regiones sensoriales primarias podrían estar relacionados con las diferencias generalizadas en el procesamiento sensorial en el TEA, tan generalizadas que se han incluido en criterios diagnósticos del DSM5. Observamos que la sobreexpresión de los genes de la respuesta inmunitaria y la microglía reactiva, junto con la disminución de los genes de la morfogénesis de neuritas y de las vías de energía neuronal, no solo se ven afectados en toda la corteza cerebral en el TEA, sino que también presentan un gradiente regional que refleja elementos fundamentales de la citoarquitectura cortical. Cabe destacar que la magnitud de los cambios en la expresión diferencial regional en el TEA es paralela a los patrones observados de IRA, lo que concuerda con que representan manifestaciones de un proceso biológico subyacente común.
Dados estos resultados, junto con nuestras observaciones de desregulación neuronal generalizada presente en toda la corteza del TEA, los trabajos futuros deberían determinar cómo los cambios en los genes de riesgo del TEA afectan la formación de patrones y la conectividad corticales. Esto es especialmente relevante, ya que la IRA en el TEA puede ser una manifestación de una alteración temprana del desarrollo en la realización cortical, que involucra tanto factores intrínsecos celulares (por ejemplo, programas reguladores genéticos o epigenéticos) como respuestas a señales extrínsecas, como gradientes de morfógenos y entradas talámicas.
Dada la conexión entre la cito-arquitectura regional, los circuitos locales y la conectividad cerebral de largo alcance, la parsimonia sugiere que, además de las contribuciones a la formación de patrones de desarrollo, la disminución de la identidad regional transcriptómica refleja cambios en la función del circuito neuronal local y en la homeostasis sináptica, ampliamente difundidos. Esto se sustenta en la observación de que el módulo de co-expresión GeneM5, que representa los genes de plasticidad sináptica, presenta una expresión negativa en toda la corteza cerebral en pacientes con TEA. Además, GeneM5 presenta una mayor cantidad de genes que albergan variantes de riesgo comunes y raras asociadas con TEA, lo que concuerda concuerda con la posible relación causal de la expresión negativa de este módulo con el TEA. Si bien una única imagen post mortem no permite distinguir entre los mecanismos mencionados, nuestros resultados justifican con firmeza su posterior investigación experimental, como la elaboración de perfiles genómicos pancorticales específicos para cada tipo de célula del cerebro humano durante el desarrollo temprano y el desarrollo de sistemas organoides que recapitulen las identidades regionales.
Diversas consideraciones técnicas y biológicas deben guiar la interpretación de estos resultados. Las muestras utilizadas se obtuvieron de tejido cortical post mortem heterogéneo, que representa una amplia gama de sujetos de ambos sexos, con edades comprendidas entre los 2 y los 68 años. Se empleó una metodología rigurosa para tener en cuenta la variabilidad biológica y técnica, garantizando que los resultados aquí presentados sean conservadores y generalizables. Para abordar los problemas de resolución celular y variabilidad de la disección en las regiones corticales, realizamos snRNA-seq, lo que mejoró aún más nuestra comprensión de la variación regional en la desregulación transcriptómica del TEA.
Sin embargo, los experimentos de snRNA-seq suelen tener menos muestras únicas que los experimentos de RNA-seq en masa, y la comparabilidad de las proporciones de tipos celulares de snRNA-seq con las proporciones reales de tipos celulares actualmente no está clara35. También resulta difícil estimar las transcripciones cuantitativamente utilizando métodos de RNA-seq de células individuales, mientras que esto sigue siendo una fortaleza de la RNA-seq en tejido en masa, especialmente cuando se combina con el análisis de redes36. Aprovechando esto, posteriormente identificamos un módulo de coexpresión específico de transcripción sobreexpresado, enriquecido con variantes de GWAS de TEA, lo que implica por primera vez la disfunción del plegamiento de proteínas como una posible vía que contribuye a los mecanismos causales del TEA. Cabe destacar que la proteostasis regulada positivamente también está implicada en el síndrome de Down, y se ha identificado un mecanismo similar de choque térmico como una posible diana farmacológica en el complejo de esclerosis tuberosa, lo que indica que este podría ser un proceso biológico afectado en múltiples trastornos del neurodesarrollo.
Será necesario emplear métodos con mayor resolución celular para refinar aún más los resultados presentados aquí para tipos específicos de células corticales.
A medida que buscamos comprender completamente la patología neuronal del TEA, serán esenciales futuros enfoques que integren diferentes fuentes de datos biológicos, incluido este recurso transcriptómico de toda la corteza, para determinar cómo los genes de riesgo de TEA afectan al cerebro.