LABORATORIO DE URGENCIAS

Diferencias Genéticas en Tuberculosis - Enfermedades Muy Diferentes

                                                                        Arianne Lovey, Sheetal Verma, Rodrigo Ribeiro-Rodrigues,seema Husain,
                                                               Moises Palaci,Reynaldo Dietze, Shuyi  Ma, Robert Morrison, David. R.                                                                             Sherman, Jerrold Elner & Padmini Salgame 

                                                                                     Nature Communications(2022); volume 13, number: 884 

Tuberculosis existe desde hace unos 150 millones de años (WHO). La primera infección de tuberculosis en una persona pudo haber ocurrido hace unos 9.000 años, y el patógeno sigue siendo una de las principales causas de muerte; infecta a unos 10 millones de personas y mata a 1,5 millones cada año en todo el mundo. La tuberculosis puede propagarse cuando una persona infectada habla, tose o expulsa aire de forma similar.
Detener la transmisión de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es esencial para reducir la carga de tuberculosis (TB) a nivel mundial y alcanzar los objetivos de la Estrategia Fin de la TB. La transmisión de Mtb de una persona con tuberculosis a otras personas está significativamente influenciada por la cantidad de gotitas infecciosas en el aire expulsadas por una persona infectada mediante procesos espiratorios como la tos y los estornudos. Estudios de muestreo de aire realizados en salas de tuberculosis revelaron una transmisión desigual de la infección de los pacientes a los animales de prueba, a pesar de una positividad comparable en el esputo.
Estudios con sistemas de medición de aerosoles de tos y estudios de epidemiología molecular también indican que algunas personas con tuberculosis son más infecciosas que otras. Sin embargo, los mecanismos responsables de esta variabilidad en la transmisión entre individuos con tuberculosis no se comprenden bien. El complejo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) se ha divergido en varios linajes adaptados a los humanos y la evidencia acumulada indica que la diversidad genotípica puede determinar la virulencia y la transmisibilidad de los aislados clínicos de MTBC e influir en el desenlace de la enfermedad de tuberculosis (revisado en [texto incoherente]. Los linajes "modernos" de Mtb inducen niveles bajos de citocinas inflamatorias y se asocian con una tasa de crecimiento más rápida en macrófagos en comparación con los linajes "antiguos" de Mtb. En consonancia con la respuesta inflamatoria atenuada, las subcepas de la cepa W-Beijing causan una enfermedad más grave en humanos y en modelos animales. Sin embargo, la comparación de los linajes "antiguos" y "modernos" juntos no reveló una correlación directa entre la baja inducción de citocinas in vitro y la alta virulencia en ratones. Los estudios descritos anteriormente utilizaron la agrupación frente a la no agrupación de aislados de Mtb caracterizados por genotipificación molecular como un indicador de transmisión y, por lo tanto, no han considerado los factores ambientales ni, específicamente, la infecciosidad del caso índice. Para abordar estas limitaciones, realizamos un estudio en Brasil de contactos domésticos. (HHC) de casos de tuberculosis infecciosa. Se encontró heterogeneidad en la transmisión de Mtb dentro de los hogares, que no se explica fácilmente por el contacto doméstico ni por factores ambientales. Sin embargo, el estudio encontró que el caso índice de hogares con alta transmisión presentó una asociación significativa con una tos más intensa y una tendencia hacia la significancia en la presencia de cavitación en la radiografía de tórax.
Dado que se encuentran numerosos bacilos en la superficie de las cavidades con mayor potencial de escape a las vías respiratorias, esto sugiere que los factores reguladores de la patología inducidos por la cepa en los individuos infectados podrían contribuir significativamente a la variabilidad en la transmisión.
Para analizar la compleja interacción del patógeno con el huésped que conduce a la heterogeneidad en la transmisión, examinamos, en un estudio previo, cepas de Mtb del caso índice de origen de hogares con alta transmisión (HT) y baja transmisión (LT) en el modelo murino de tuberculosis C3HeB/FeJ. Encontramos que los ratones C3HeB/FeJ infectados con cepas de Mtb-LT mostraron una carga bacteriana significativamente mayor en comparación con las cepas de Mtb-HT y desarrollaron patología pulmonar inflamatoria neutrofílica difusa. En un estudio riguroso Por el contrario, los ratones infectados con cepas de Mtb-HT desarrollaron granulomas caseosos discretos, un tipo de lesión con alto potencial de cavitación y ninguno desarrolló patología inflamatoria difusa.
En general, los hallazgos de nuestro estudio publicado indican que, al inducir una patología progresiva rápida, la Mtb-LT crea un entorno que no favorece el escape de bacterias a las vías respiratorias, sino que, si no se trata, conlleva una mayor mortalidad. La Mtb-HT, por otro lado, causa una enfermedad patológica mínima y se encuentra inicialmente contenida dentro de granulomas, pero estos progresan posteriormente a una fase necrótica caseosa, creando un entorno en el que es posible el escape bacteriano a las vías respiratorias y, por lo tanto, la transmisión. Por lo tanto, los estudios en el modelo C3HeB/FeJ vinculan el fenotipo clínico de las cepas de Mtb con un fenotipo experimental distinto, lo que proporciona una herramienta poderosa para investigar más a fondo los eventos tempranos de interacción huésped-patógeno. Cabe destacar que tanto las cepas Mtb-HT como Mtb-LT pertenecen al linaje [insertar nombre del linaje] y, sin embargo, presentan rasgos de virulencia específicos de la cepa, lo que concuerda con un estudio a nivel de genoma completo que muestra que incluso cepas estrechamente relacionadas presentan diferencias genéticas. Aquí, informamos que las diferencias en la interacción temprana de Mtb-HT y Mtb-LT con macrófagos alveolares (MA) sentaron las bases para la trayectoria diferencial en el crecimiento bacteriano y la formación de granulomas. La captación de Mtb-HT por los MA condujo a una rápida localización en el intersticio pulmonar de manera dependiente de IL-1R, seguida de una rápida diseminación de bacterias a los ganglios linfáticos de drenaje, cebado Th1 y reclutamiento de células T a los pulmones. El resultado de estos mecanismos tempranos fue la inducción de una respuesta granulomatosa y la restricción del crecimiento de Mtb-HT. Por el contrario, la interacción de Mtb-LT con los MA detuvo su migración al intersticio, impidiendo así el transporte de bacterias a los ganglios linfáticos (LN) y el cebado Th1, lo que resultó en un retraso sustancial en la llegada de células T específicas de antígeno a los pulmones. La falta de cebado Th1 desvió la diferenciación de las células T hacia una respuesta dominante Th17, lo que permitió la infiltración neutrofílica y la posterior patología pulmonar diseminada. Previamente, hemos reportado la caracterización de un panel de cepas Mtb-HT y Mtb-LT. En este estudio, se eligieron Mtb-HT1 y Mtb-LT1 como cepas prototípicas de alta y baja transmisión. Mtb-HT2 y Mtb-LT2 también se estudiaron en experimentos seleccionados.

RESULTADOS

Como se observó previamente, una replicación significativamente mayor en los pulmones de Mtb-LT1 en comparación con Mtb-HT1 en las semanas 3 y 11 posteriores a la infección. El análisis del crecimiento bacteriano en el punto temporal inicial de 2 semanas reveló unidades formadoras de colonias (UFC) pulmonares similares entre los ratones infectados con Mtb-HT1 y Mtb-LT1, pero la observación más notable fue la carga bacteriana significativamente mayor en los ganglios linfáticos y el bazo de los ratones infectados con Mtb-HT1 en comparación con los ratones infectados con Mtb-LT1.
Estudios previos han demostrado que la diseminación de Mtb al ganglio linfático debe ocurrir antes del desarrollo de una respuesta inmunitaria adaptativa y que el reclutamiento resultante de linfocitos T CD4+ a los pulmones es directamente proporcional al número de bacterias viables en el ganglio linfático. Por lo tanto, a continuación, examinamos el grado de activación y la expresión de citocinas de los linfocitos T en los ganglios linfáticos de drenaje de ratones infectados a las 2 y 4 semanas. Observamos que tanto el número total de células como el número de linfocitos T CD4+CD69+ activados fueron significativamente mayores en la semana 2 en los ganglios linfáticos de los ratones infectados con Mtb-HT1 en comparación con los ratones infectados con Mtb-LT1. La tinción intracitoplasmática reveló un aumento significativo de las células que expresaban IFNγ e IL-17 entre las células T CD4+CD69+ en ratones infectados con Mtb-HT1. Esto indicó que hubo una mayor preparación de células T CD4+ en la semana 2 después de la infección en la infección por Mtb-HT1, ya que la aparición de células T CD4+CD69+ es la primera evidencia de preparación de células T CD4+ en los ganglios linfáticos durante la infección por Mtb27. El CD44 también es un marcador de activación de células T y, de manera similar, se observó un aumento significativo de células IFNγ+ e IL-17+ entre las células T CD4+CD44+ de ratones infectados con Mtb-HT1 en la semana 2 después de la infección. En la semana 4 después de la infección, el número de células T CD4+CD69+ activadas aumentó en ambos grupos y los números ahora eran equivalentes en este punto temporal. Sin embargo, el número total de células secretoras de IFNγ entre los linfocitos T activados en los ganglios linfáticos de los ratones infectados con Mtb-LT a las 4 semanas no alcanzó el nivel de los ratones infectados con Mtb-HT1. Si bien las células que expresan IFNγ se mantuvieron en Mtb-HT1 a las 4 semanas de infección, se observó una marcada contracción de los linfocitos T IL-17+. En marcado contraste, en la infección con Mtb-LT1, los linfocitos T CD4+ que expresan IL-17 aumentaron y fueron significativamente mayores en comparación con la infección con Mtb-HT1.
En conjunto, los datos hasta la fecha indican que no solo existe un retraso, sino también una diferencia fenotípica en la respuesta de las células T en ratones infectados con Mtb-LT1 en comparación con los ratones infectados con Mtb-HT1. Este hallazgo establece que, en la infección por Mtb-LT, la diseminación tardía de Mtb a los ganglios linfáticos no produce una supresión completa de la activación y diferenciación de las células T, sino que posteriormente se desvía hacia una respuesta dominante Th17.

DISCUSIÓN

En este estudio, identificamos el mecanismo que impulsa la divergencia en el crecimiento y la patología de patógenos en ratones C3HeB/FeJ infectados con Mtb-HT y Mtb-LT. Descubrimos que los MA infectados con Mtb-HT, de forma dependiente de IL-1R, migran rápidamente al intersticio para iniciar la activación Th1 y facilitar la formación de granulomas. Por el contrario, en la infección por Mtb-LT, la activación de Th1 se ve frenada debido a la migración retardada de los macrófagos amnióticos infectados, lo que resulta en una respuesta Th17 sesgada y una patología inflamatoria pulmonar.
El pulmón está constantemente expuesto a antígenos inocuos y, para mantener la homeostasis inmunitaria tisular, los macrófagos amnióticos, a diferencia de otros subgrupos de macrófagos, han adquirido un fenotipo regulador. De hecho, las modificaciones de la cromatina en los macrófagos amnióticos son distintas a las de otras poblaciones de macrófagos residentes en los tejidos. Para limitar la inflamación de las vías respiratorias, los macrófagos amnióticos adquieren un fenotipo inmunosupresor e inmunorregulador y expresan reguladores negativos como el receptor CD200. Los macrófagos amnióticos también mantienen un fenotipo M2 con un metabolismo sesgado hacia la oxidación de ácidos grasos. Durante la infección in vivo temprana en ratones, los macrófagos amnióticos sobrerregulan un programa transcripcional dependiente de Nrf que limita la producción de IL-1β y TNF, lo que afecta el control de Mtb. En general, los MA presentan un entorno propicio para el crecimiento de Mtb, y es necesario superar el umbral del entorno inmunorregulador para que se produzca una respuesta inmunitaria tras la infección por Mtb. Nuestros datos, que muestran diferencias en la respuesta innata temprana, en particular la inducción de IL-1α e IL-1β por los MA, en ratones infectados con Mtb-HT y Mtb-LT, sugieren que los MA en la infección por Mtb-LT son incapaces de anular su entorno inmunorregulador.
Los procesos precisos mediante los cuales las células Th1 orquestan la respuesta granulomatosa y controlan la infección por Mtb dentro de esta estructura aún no están claros, pero la activación y el reclutamiento oportunos a los pulmones de las células Th1 son un prerrequisito para fomentar estos procesos. Mtb se detecta antes en los ganglios linfáticos de los ratones C57BL/6, relativamente resistentes, en comparación con la cepa C3H/HeJ, relativamente susceptible, y esto se correlaciona con la capacidad de los ratones C57BL/6 para controlar mejor la infección por Mtb. La migración de células dendríticas (CD) es esencial para la preparación de linfocitos T y existen evidencias que sugieren que Mtb puede retrasar la activación de los linfocitos T efectores al inhibir la apoptosis de macrófagos,38 un paso necesario para la preparación cruzada de CD.
Observamos que el retraso en la migración de MA en la etapa temprana de la infección por Mtb-LT afecta la fase adaptativa posterior de la preparación de linfocitos T. Este retraso significativo adicional tiene importantes consecuencias para el tipo de linfocitos T efectores específicos de antígeno que se desarrollan en la infección por Mtb-LT. Observamos que el retraso significativo en la activación de linfocitos Th1 en la infección por Mtb-LT desvía la diferenciación de linfocitos T a una respuesta dominante Th17. En un modelo murino de coinfección por el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) y Mtb, la susceptibilidad de los ratones a la infección por Mtb aumenta. La infección viral preexistente en los animales coinfectados provocó un retraso en la preparación de linfocitos T específicos de Mtb y una menor acumulación de linfocitos Th1 específicos de antígeno. Sin embargo, al igual que en los ratones infectados con Mtb-LT, se observó una expansión de células Th17 en los animales coinfectados. Si bien la causa del retraso en la sensibilización de células T en los ratones coinfectados y en los infectados con Mtb-LT es diferente, resulta interesante que se observara una expansión sesgada similar de células Th17 en ambos modelos de infección tras la sensibilización de células T. Los ratones que carecen de IFNγR en el compartimento no hematopoyético desarrollan una patología inflamatoria neutrofílica desregulada, caracterizada por la sobreexpresión de IL-17. La señalización de IFNγR restringe la expansión de IL-17 mediante la inducción de la indol-2,3-dioxigenasa (IDO) y, en ausencia del receptor, esta interrupción en la expansión de IL-17 se elimina. Es posible que la expresión reducida de IFNγ observada en los ratones infectados con Mtb-LT1 y la consiguiente restricción de la señalización de IFNγR hayan facilitado la expansión de células Th17 en los ratones. En conjunto, los datos hasta la fecha indican que no solo existe un retraso, sino también una diferencia fenotípica en la respuesta de las células T en ratones infectados con Mtb-LT1 en comparación con los ratones infectados con Mtb-HT1.
Este hallazgo establece que, en la infección por Mtb-LT, la diseminación tardía de Mtb a los ganglios linfáticos no produce una supresión completa de la activación y diferenciación de las células T, sino que posteriormente se desvía hacia una respuesta dominante Th17.
La IL-1 se ha vinculado al aumento de la inflamación pulmonar y la gravedad de la tuberculosis. En ratones susceptibles, la señalización persistente de IL-1β aumenta la inflamación granulocítica, lo que conduce a un aumento de la inmunopatología y la replicación bacteriana. En la cepa de ratón C57BL/6, relativamente resistente, el inicio de la inmunidad adaptativa y la producción de IFNγ reducen la producción excesiva de IL-1β mediante la inhibición del procesamiento de pro-IL1β mediada por NOS2. Un polimorfismo natural en la región promotora de IL1B humana, que conduce a una alta producción de IL-1β, se asocia con el desarrollo de tuberculosis activa, la gravedad de la enfermedad y un mal pronóstico del tratamiento. En consonancia con su papel en la exacerbación de la patología pulmonar, la inflamación pulmonar total se redujo significativamente en macacos infectados con Mtb tratados con Anakinra, un antagonista del receptor de IL-1, y el fármaco antituberculoso Linezolid, en comparación con los animales que recibieron solo el fármaco. Si bien el exceso de IL-1β es inmunopatológico, la disponibilidad de la citocina durante la fase temprana de la infección es crucial para la protección del huésped. Sin una señalización IL-1 intacta, como la observada en ratones que carecen de IL-1α, IL-1β o IL-1R1 intactas, la infección por Mtb produce un aumento significativo de la carga bacteriana y un mayor número de células infectadas por Mtb. Se han propuesto varios mecanismos para el control de la infección por Mtb mediado por la señalización IL-1R. Por ejemplo, la IL-1 suprime la producción de IFN tipo 1, que favorece el crecimiento de Mtb.
Otro estudio reveló que las células mieloides Ly6Ghi reclutadas en pulmones infectados por Mtb requieren una autorización dependiente de IL-1R para regular positivamente el TNF-RI y producir especies reactivas de oxígeno para el control de patógenos. Los hallazgos de nuestro estudio implican que, al controlar la migración de MA, la señalización IL-1R afecta indirectamente la rapidez de la diseminación de Mtb a los ganglios linfáticos para la preparación de linfocitos T y el consiguiente reclutamiento temporal de linfocitos T a los pulmones y la formación de granulomas, vital para la restricción del crecimiento de patógenos. Es importante destacar que nuestros datos indican que Mtb-LT puede manipular esta vía para retrasar la preparación para Th1 y desviar la respuesta granulomatosa a la de la inflamación descontrolada. Aunque a primera vista parece contradictorio con nuestro hallazgo de que los ratones que carecen de los ligandos para IL-1R (ratones Il1a−/−Il1b−/−) desarrollan inmunidad adaptativa Th1, cabe destacar que este estudio no evaluó la preparación de células T ni la expresión temprana de IFNγ en los ganglios linfáticos. Como observamos también con las infecciones por Mtb-HT y Mtb-LT, la expresión similar de IFN entre los ratones WT e Il1a−/−Il1b−/− se observó a los 30 días de la infección, probablemente como reflejo del aumento de la carga bacteriana. En nuestro estudio, al inhibir transitoriamente la señalización de IL-1R solo durante la infección temprana, pudimos descubrir un papel único de la señalización de IL-1R en el inicio de la respuesta adaptativa de las células T y la formación de granulomas, y establecer cómo las cepas de Mtb pueden explotar esta vía para producir distintos desenlaces patológicos en el huésped. Estudios futuros deberían examinar el papel de los mecanismos secuenciales tempranos dependientes de IL-1R en la determinación de los desenlaces patológicos a largo plazo en individuos expuestos a Mtb y cómo esto afecta la transmisión del patógeno desde el caso fuente.
La heterogeneidad en la respuesta del huésped inducida por las infecciones por Mtb-HT y Mtb-LT también podría afectar los resultados del tratamiento de la tuberculosis. A pesar de completar con éxito el tratamiento, un número significativo de pacientes presenta deterioro pulmonar. Nuestros hallazgos sugieren que la intensa patología inflamatoria inducida por Mtb-LT es un factor de riesgo de daño pulmonar post-tuberculosis.
Estudios futuros deberían caracterizar el impacto de la heterogeneidad de las cepas de Mtb en los mecanismos inmunitarios y los resultados del tratamiento, lo que permitirá el diseño de nuevas intervenciones terapéuticas eficaces dirigidas al huésped..
El linaje 4 de MTBC comprende 10 sublinajes separados y, mediante WGS, identificamos Mtb-HT1 como L4.1.2.1 y Mtb-LT1 como L4.3.4.2.
Los estudios que examinan las consecuencias biológicas de las variaciones genotípicas dentro de los sublinajes son limitados. En un estudio realizado en San Francisco, EE. UU., un sublinaje del linaje 4 difirió significativamente en su transmisibilidad en comparación con otras cepas del linaje. Una revisión sistemática del MTBC en África no reveló ninguna relación entre el linaje Mtb y la presentación clínica de la enfermedad, pero dentro del linaje 4 se encontró que algunos sublinajes se asociaban con mayor frecuencia con la tuberculosis ganglionar que con la tuberculosis prematura. Queda por determinar qué variaciones genotípicas dentro de los sublinajes Mtb-HT y Mtb-LT regulan el resultado fenotípico distintivo en el huésped. Entre los posibles objetivos se incluye la proteína PE_PGRS33, altamente polimórfica y expresada en superficie, con propiedades inmunomoduladoras. El análisis de un amplio panel de aislados clínicos de Mtb reveló que aquellos con PE_PGRS33 alterado presentaban una asociación más significativa con la ausencia de enfermedad cavitaria, lo que sugiere un papel en la patogénesis de esta proteína. Dado que PE_PGRS33 también es polimórfico dentro de un linaje, es posible que la variación en la expresión de PE_PGRS33 contribuya a diferentes fenotipos inmunitarios a nivel de sublinaje con Mtb-HT1 y Mtb-LT1. Los lípidos de la pared celular de las micobacterias desempeñan importantes funciones biológicas en la determinación de la virulencia y la patogénesis del huésped. Se ha observado variación en el contenido de sulfátidos y otros derivados acilados de la trehalosa entre cepas dentro del linaje 4. Dado que los mutantes de Mtb afectados por la biogénesis de sulfatidas presentan una virulencia reducida en el modelo murino de infección por Mtb y que el sulfolípido-1 estimula las neuronas nociceptivas y desencadena la tos, se sugiere que los próximos trabajos deberían cuantificar la producción de SL-1 y otros lípidos a partir de Mtb-HT y Mtb-LT, y examinar su vínculo con la respuesta temprana a las citocinas en los MA y la posterior respuesta patológica distintiva en el huésped.
Además de las variantes genómicas, mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN regulan la expresión génica. Se han descrito patrones de metilación específicos del linaje de Mtb y la expresión de distintas ADN metiltransferasas en los linajes 2 y 4. También se han descrito diferentes patrones de metilación dentro del linaje 4, lo que respalda que el examen del metiloma de Mtb-HT y Mtb-LT podría proporcionar nuevas diferencias funcionales entre ellos y comprender mejor las respuestas inmunitarias y patógenas del huésped dependientes de la cepa.
En conclusión, los estudios futuros deberían definir completamente las características genéticas de las cepas de Mtb de alta y baja transmisión que regulan su fenotipo in vivo y su patrón de presentación clínica.